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这些蛋白质互作实验方法,你都了解吗?
人阅读 发布时间:2022-07-11 22:57
这些蛋白质互作实验方法,你都了解吗?
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)对解析生命活动过程与疾病发生发展过程至关重要。随着时代发展,虽然大规模、高通量的生物学研究手段大大促进了蛋白质相互作用的预测,但这种预测还需要进一步利用体外和体内系统进行验证。分析蛋白质互作的方法多种多样,本篇文章为大家介绍以下几种互作分析技术:
免疫共沉淀 Co-IP
免疫沉淀 (IP) 、免疫共沉淀(Co-IP) 和pull-down 都是常用的从复杂的混合样品中获取目标分子,以进行下一步分析的方法,如检测蛋白质能否相互作用。在此类实验中,被研究的蛋白质称为“诱饵”蛋白,“诱饵”蛋白的互作蛋白称为“猎物”蛋白。“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白结合后,利用靶蛋白—抗体—Protein A/G—磁珠/琼脂糖珠的结合方式获取复合物,再通过SDS-PAGE、Western blot 或质谱等方法进一步对复合物中的靶蛋白进行分析。
免疫共沉淀方法简单,是识别感兴趣蛋白质的相互作用、深入了解其结构和功能的初步实验方法。但是它也有相应的局限性,比如很难验证两种蛋白质是否直接发生相互作用、不能得到这种相互作用亲和力等定量信息等。因此需要在相互作用分析与筛选后,使用其他方法验证更详细的相互作用信息。
图1:使用抗体进行Co-IP 与使用 Strep-Tactin®XT进行pull-down
融合蛋白沉降pull-down
IP和Co-IP通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子,而pull-down可使用带亲和标签的目的蛋白进行,在体外验证蛋白间的直接相互作用。Pull-down是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的“诱饵”蛋白,从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获“猎物”蛋白,然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析,从而确认互作蛋白的“身份”。Pull-down较Co-IP的优点在于,不仅能证实靶蛋白的直接相互作用,且洗脱条件也很温和,保留蛋白质结构与天然蛋白复合体的同时,又避免将非特异性结合的蛋白质共同洗脱下来,确保了后续分析的准确性。这一优点在Strep-tag技术中充分体现。图2为应用MagStrep“type3”XT 磁珠进行蛋白质Streppull-down步骤图。
图2:Strep pull-down互作蛋白质分析示意图。
A: Strep-Tactin®XT包被磁珠;B:固定带有Twin-Strep-tag®标记的“诱饵”蛋白;C:孵育“诱饵”蛋白与含有“猎物”蛋白的溶液;D:“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白形成复合物;E:复合物蛋白进行凝胶分析;F:复合物蛋白进行质谱分析
表面等离子共振SPR
表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance, SPR)技术是一种基于物理光学现象的检测技术,是分析生物分子间结合作用的常用方法之一,通过直接、实时、无标记的测量来分析分子间的亲和力及动力学参数,在生物治疗药物的发现和开发中发挥着重要作用。
SPR的原理是在芯片表面固定一层生物分子识别膜,然后将待测样品流过芯片表面,若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子,会引起金膜表面折射率变化,最终导致SPR角变化,通过监测SPR的角度变化,获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等。
图3:SPR检测原理与Strep-Tactin®XT包被的感受器晶片
图三中所示的基于Strep-tag®系统方法,采用是间接的捕获方式来分析目的蛋白,解决配体稳定性差、纯度低、再生困难的同时,可进行定向、高亲和力的配体固定,实现长解离时间和慢解离速率的测量,最小化非特异性结合。
生物膜干涉 BLI
生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry, BLI), 是一种无标记(Label-free)光学生物传感技术,用于实时监测分析生物分子相互作用(例如抗原-抗体相互作用),并对其结合强度和动力学进行量化分析。与SPR技术不同的是,BLI技术中不使用金属芯片,而是利用生物传感器。将配体偶联在传感器的末端,浸入样品中来捕获分析物。
图4:BLI传感器与Strep-Tactin®XT 相结合,特异性捕获Twin-Strep-tag® 融合蛋白
当光束射出后,对来自生物传感器末端表面的反射光进行测量,如果配体与分析物相互作用,则末端表面的膜层比仅有配体(未结合分析物)的膜层更厚,反射光波长也不同,两种反射光谱之间的波长形成一束干涉光谱。BLI 仪器通过测量来自配体,或配体-分析物的复合物的干涉光谱位移值,实现结合强度和动力学的实时监测。
邻近蛋白标记BioID
邻近蛋白标记(biotinidentification,BioID,生物素标记)方法可以鉴定诱饵蛋白附近的蛋白质。通过将生物素连接酶(BirA)与诱饵蛋白融合表达,加入适量生物素,融合蛋白的相互作用/附近环境中的蛋白质会被生物素化。之后通过链霉亲和素或Strep-Tactin®进行亲和纯化,将被生物素化的蛋白质从细胞裂解液中富集出来,产物做质谱鉴定。
图5:BioID的原理
以上即为几种常用的蛋白质互作研究方法,另外还有很多其他相关技术可以探索。
值得一提的是,文章中所用图示与示例均来自Strep-tag®技术。近年来,Strep标签的应用场景已从蛋白纯化拓展至下游的分析研究。得益于其中Twin-Strep标签与新一代Strep-Tactin®XT的搭配组合,多种检测与互作研究产品被投入使用。这种标签-配体的搭配有高至pM级亲和力,能在增加蛋白纯度与产量的同时,提升效率降低背景。尤其是在需要高和力的实时互作分析中,Strep-tag®技术可以助您从复杂样品中特异性捕获Twin-Strep标记的融合蛋白,从而获得可靠的数据。
德国IBA Lifesciences深耕Strep-tag®技术研发领域,提供多种形式的Strep-Tactin®/XT产品,如微孔板、荧光、晶片等。为多种多样分离后的下游研究提供解决方案,特别是药物筛选、诊断测定、蛋白质动力学以及相互作用研究等,如SPR、BLI分析的试剂套裝。
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参考来源:
1. https://www.iba-lifesciences.com/
2. Specific_Elution_and_Avoidance_of_Contaminations_in_BioId, IBA Lifesciences
3. The Strep-Tactin®XT technology in downstream applications,IBA Lifesciences
4. 免疫学技术及其应用,2010,526-549
5. 【前沿技术】SPR在药物筛选中的应用,分子技术达论