机体免疫应答过程的复杂性和严格的调控性，是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与完成的。而T淋巴细胞的活化，在免疫应答中扮演着相当重要的角色。研究表明，诱导T细胞的活化与增殖需要两种信号：一种是 TCR/CD3 与抗原提呈细胞（APCs）表面特异的 MHCⅡ 抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；另一种是非特异性协同刺激信号，由 APCs 表面的协同刺激分子和 T 细胞的相应受体相互作用后产生，其中 CD28/B7 是最为重要的协同刺激分子，能增加 IL-2 的产生，加速T细胞增殖，阻止细胞进入无反应状态或死亡。



在体外联合使用 CD3 和 CD28 的抗体刺激 T 细胞，模拟 T 细胞活化的双信号作用，是进行 T 细胞激活与扩增应用最广泛的方法。除直接使用功能学抗体以外，目前磁珠法（CD3/CD28 抗体偶联磁珠）以及多聚体法（CD3/CD28 抗体偶联 Streptamer 多聚体）也是激活扩增 T 细胞比较常见的两种方法。以上说到的无论是抗体法、磁珠法、亦或者是多聚体法，归根结底都是借助于 CD3 与 CD28 抗体对 T 细胞进行刺激。


下面，我们以小鼠脾脏样本为例，分享分别利用 CD3 与 CD28 的功能学抗体，以及 CD3/CD28 Streptamer^® 激活扩增 T 细胞的实验步骤与实验结果。


CD3/CD28抗体法
1、实验步骤：
1.1 抗体包被
用无菌 PBS 将 anti-mouse CD3 抗体（克隆号：145-2C11）稀释至 5μg/ml，稀释后的抗体加入到 24 孔板中，每孔 400μl，4°C 包被过夜。（注：板子在加入抗体之前，先用无菌 PBS 润洗 2-3 遍，避免干孔）；

1.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离（次日）
1. 将 70μm 细胞筛网置于培养皿中，取小鼠脾脏放置于筛网中，加入 5ml 达优小鼠淋巴细胞分离液，对脾脏轻轻进行研磨（注：此步操作要快，避免分离液蒸发）；
2. 把悬有脾脏细胞的的分离液立即转移至 15ml 离心管中，随后在分离液上层轻轻覆盖 500-1000μl 的 RPMI1640 培养基（保持分离液与培养基分界明显）；
3. 室温，水平转子 800g 离心 30 分钟，设置离心机为缓升缓降；
4. 离心结束后吸出淋巴细胞层（白膜层），加入 10ml RPMI1640 洗涤一遍细胞，250g 离心 10 分钟收集细胞；
5. 将上一步离心得到的细胞沉淀，重悬至扩增培养基中，并进行计数。

1.3 细胞刺激（次日）
扩增培养基成分：RPMI1640 + 10% 血清 + 5ug/ml anti-mouse CD28（克隆号：37.51） + 双抗
1. 将细胞浓度调整至 1-2×10^6/ml（本次实验为 2×10^6/ml，该浓度偏大）；
2. 从 4°C 冰箱取出前一天包被的板子，弃掉包被液，无菌PBS洗涤3遍；
3. 每孔加入 500μl 细胞悬液，放置于 37°C 含 5% CO₂ 细胞培养箱中培养。

2、实验结果

图：1×10^6/孔细胞，5μg anti-mouse CD3与CD28刺激3天后细胞形成明显克隆团


CD3/CD28 Streptamer^® 多聚体法

1、实验原理
使用低亲和力的抗 CD3 和抗CD28的抗体 Fab 片段（非传统全长抗体），结合上 Twin-Strep-tag 亲和标签，形成 CD3 Fab-Strep 和 CD28 Fab-Strep。再结合可溶性蛋白多聚体 Strep-Tactin^®，在亲和力作用下，即可与 TCR 和 CD28 共刺激受体多价结合，来传递激活信号。该方法最大的优势是在刺激过程中，能够通过加入 biotin 移除刺激试剂，达到精确掌控活化时间的目的。


2、实验步骤
小鼠脾脏淋巴细胞的分离与上面抗体法中步骤相同，当然，也可以选择用分选试剂盒进一步分选得到 T 淋巴细胞进行刺激。（注：如果选择提前富集T淋巴细胞，建议使用阴选试剂盒或可以去除分选试剂的阳选试剂盒）

1. 将 CD3 Fab-Strep、CD28 Fab-Strep、Strep-Tactin^® Multimer 按照 1:1:1 的比例进行混合，4°C 孵育 20 分钟，期间进行连续搅拌，如果是在静置条件下孵育中间进行几次吹打混匀，该孵育时间可适当延长。孵育结束制备得到 CD3/CD28 Streptamer^® 混合物；
2. 用培养基（成分：RPMI1640 + 10% 血清 + 50U/ml IL-2 ）调整细胞浓度至 5×10^5/ml，将步骤（1）中制备好的 CD3/CD28 Streptamer^® complexes 与细胞悬液进行混合，轻轻吹匀后，将细胞加入到细胞培养板中，放置于 37°C 含 5% CO₂ 细胞培养箱中培养。细胞数量、培养基体积、多聚体用量配比参考以下表格：

 

培养板	96 孔板	48 孔板	24 孔板
T 细胞数量	5-8×10^4	2-5×10^4	0.5-1×10^6
培养基体积（ml）	0.1-0.2	0.5-1	1-2
CD3/CD28 Streptamer premix（μl）	3	15	30

 

3. 培养过程中，每天观察细胞的状态，是否形成克隆团，或进行细胞计数，如果出现培养基变黄或细胞密度过高的情况，吹散细胞克隆团后调整细胞密度至0.5-1×10^6/ml，更换培养板和培养基；
4. 移除 CD3/CD28 Streptamers 终止刺激（该步根据实验需求可选做）：直接向刺激后的细胞悬液中加入终浓度为 1mM 的 Biotin，室温孵育 30 分钟。收集并转移细胞至 15ml 离心管中，加入 10ml 培养基，300g 离心 6-10 分钟，弃上清，再次加入 10ml 培养基重复一遍洗涤步骤，至此，细胞已经可以用于下游分析。

3、实验结果
以下实验结果是分选得到 T 淋巴细胞后进行的刺激，在此特别感谢德国 IBA Lifesciences 提供的内部实验数据以及详细实验步骤。

图：小鼠脾脏 T 淋巴细胞扩增至 3 天时，显微镜下观察细胞克隆团的形成


图：小鼠脾脏 T 淋巴细胞扩增过程中，通过流式细胞术实时检测 T 细胞激活 marker CD25、CD69 的表达变化情况



相关关键试剂

• CD3/CD28 Streptamer^® 多聚体法：

 

货号	名称	厂家
6-3201-002	CD3 Fab-TACS® Agarose column Starter Kit	IBA
6-8920-050	CD3/CD28 Streptamer® Kit, mouse	IBA